ขั้นตอนการทำ Gene cloning

ขั้นตอนการทำ Gene cloning

1. การเตรียมชิ้นส่วนของ DNA ที่ต้องการ(Preparing DNA)
2. การใช้เอนไซม์ตัดจำเพาะในการโคลนยีน(Restriction enzyme for gene cloning)
3. การเลือกใช้พาหะหรือเวคเตอร์(vector)
4. การถ่ายไฮบริดเวคเตอร์เข้าสู่เซลล์เจ้าบ้านเพื่อทำ Gene cloning(Transformation)
5. การตรวจสอบ clone ที่ต้องการ(Screening hybrid vector)
6. การประยุกต์ใช้เทคนิคพันธุวิศวกรรม(Application)

1. การเตรียมชิ้นส่วน DNA ที่ต้องการ

การเตรียมชิ้นส่วนนของ DNA ที่ต้องการนั้นเป็นขั้นตอนแรกของการทำ Gene cloning ซึ่ง DNA ที่ต้องการนั้นสามารถเตรียมได้ 4 วิธี คือ

1. Genomic DNA หรือ Chromosomal DNA
2. cDNA (complementary DNA)
3. PCR(Polymerase chain reaction)
4. การสังเคราะห์ดีเอ็นเอโดยวิธีการทางเคมี(DNA Synthesis from chemical method)
   1. Genomic DNA หรือ Chromosomal DNA

ทำได้โดยการสกัด DNA ที่มีทั้งหมดออกจากเซลล์ของสิ่งมีชีวิตที่ต้องการซึ่ง Genomic DNA ที่ได้สามารถนำมาใช้ทำเป็น Gene bank หรือ Genomic DNA library เพื่อเป็นแหล่งเก็บรวบรวมยีนทั้งหมดของสิ่งมีชีวิตนั้นหรือเฉพาะบางยีนที่ต้องการของสิ่งมีชีวิตใว้ในหลอดทดลอง

หลักการสกัดดีเอ็นเอ

ดีเอ็นเอที่อยู่ในเซลล์ของสิ่งมีชีวิต โดยทั่วไปจะไม่ได้อยู่เป็นดีเอ็นเอเกลี่ยวคู่อิสระ แต่จะรวมตัวอยู่กับโปรตีนฮีสโตนและโปรตีนที่ไม่ใช่ฮีสโตน เกิดเป็นโครงสร้างเชิงซ้อนของโครมาติน นอกจากนี้ภายในเซลล์ของสิ่งมีชีวิตยังประกอบด้วย คาร์โบไฮเดรต โปรตีน และอาร์เอ็นเอ(nascent RNA) ดังนั้นในการสกัดดีเอ็นเอออกจากสิ่งมีชีวิตต้องอาศัยหลักการดังนี้

1. การทำลายผนังเซลล์(cell wall lysis) โดยใช้ lysozyme หรือใช้สาร detergent เช่น sodium dodecyl sulfate (SDS),sodium lauryl sarcosinate
2. การย่อยโปรตีนและอาร์เอ็นเอ โดยใช้ Protease และ RNase ตามลำดับ
3. ตกตะกอนดีเอ็นเอ โดยใช้ cool absolute ethanol(อาจจะเติมเกลือ sodium citrate ด้วย)โดยเกิด dehydrate water ออกจากสายดีเอ็นเอ จากนั้นละลายดีเอ็นเอด้วยน้ำหรือ TE buffer เก็บที่ -20 C