การสร้าง Recombinant DNA(rDNA)

การสร้าง Recombinant DNA สามารถทำได้หลายวิธี ดังนี้

1. การสร้าง DNA library  คือการนำ Genomic DNA ของสิ่งมีชีวิตมาตัดด้วยเอ็นไซม์ตัดจำเพาะ แล้วนำมาเชื่อมต่อเข้ากับเวคเตอร์ซึ่งถูกตัดด้วยเอ็นไซม์ตัดจำเพาะชนิดเดียวกัน จากนั้นจึงนำไปถ่ายในเซลล์เจ้าบ้าน เพื่อขยายปริมาณชิ้นดีเอ็นเอ แล้วเก็บเซลล์เจ้าบ้าน หรือเก็บเวคเตอร์ไว้ที่ -80 องศาเซลเซียสเพื่อใช้ประโยชน์ต่อไป  ตัวอย่างการสร้าง DNA library ในแบคทีเรีย และไวรัสสามารถแสดงได้ดังรูป

• การเชื่อมต่อชิ้นดีเอ็นเอที่ต้องการเข้ากับเวคเตอร์ สามารถแบ่งได้ 3 วิธีดังนี้
  • การเชื่อมต่อดีเอ็นเอปลายเหนียว

การเชื่อมต่อดีเอ็นเอปลายเหนียวที่เกิดจากการตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะเข้ากับเวคเตอร์ที่ถูกตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะชนิดเดียวกัน

บ่อยครั้งที่พบว่าดีเอ็นเอปลายเหนียวของเวคเตอร์ที่เกิดจากการตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะนั้นเกิด Self ligation หรือ Vector dimer ซึ่งสามารถแก้ปัญหาได้โดยใช้ Alkaline phosphatase เปลี่ยนหมู่ P ที่ปลาย 5’ ให้เป็นหมู่ OH ดังนั้น Ligase จึงไม่สามารถสร้าง Phosphodiester bond ได้

• การเชื่อมต่อดีเอ็นเอปลายทู่

การเชื่อต่อดีเอ็นเอปลายทู่ที่เกิดจากการตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะเข้ากับเวคเตอร์ที่ถูกตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะชนิดเดียวกัน ซึ่งทำได้ยากกว่าการเชื่อมต่อดีเอ็นเอปลายเหนียว ดังนั้นจึงอาจจะนำดีเอ็นเอปลายทู่มาเชื่อต่อกับ DNA linker(8-10 nucleotides)ที่มีตำแหน่งจดจำเอนไซม์ตัดจำเพาะซึ่งจะตัดได้ปลายเหนียว

                หรืออาจจะแก้ปัญหาปลายทู่โดยใช้ Adaptor molecular ที่ปลายเหนียวมาเชื่อมต่อเข้ากับดีเอ็นเอที่ต้องการ