เรียลไทม์พีซีอาร์(Real-times PCR)

เรียลไทม์พีซีอาร์ เป็นวิธีการที่พัฒนามาจากพีซีอาร์พื้นฐาน เพื่อให้สามารถตรวจวัดปริมาณของดีเอ็นเอที่เพิ่มขึ้นในแต่ละรอบได้ทันที ดังนั้นจึงมักเรียกพีซีอาร์แบบนี้ว่า quantitative PCR หรือ qPCR

                ข้อดี qPCR  คือ ทำให้สามารถทราบได้ทันทีว่าปฏิกิริยาพีซีอาร์เกิดขึ้นหรือไม่และหากเกิดขึ้นปริมาณดีเอ็นเอที่ได้เป็นเท่าไหร่ โดยไม่จำเป็นต้องรอตรวจสอบหลังจากที่พีซีอาร์เสร็จสิ้นลง อย่างไรก็ตาม qPCR  มีข้อด้อยเรื่องราคาเครื่องที่แพง

                qPCR มีขั้นตอนการทำเหมือนพีซีอาร์พื้นฐาน เพียงแต่ในการทำ qPCR  จะมีการเติมสารบางอย่างลงในปฏิกิริยา qPCR เพื่อให้สามารถตรวจวัดปริมาณดีเอ็นเอที่ถูกสร้างเพิ่มขึ้นได้ตลอดเวลา ในปัจจุบันมีวิธีการตรวจวัดปริมาณดีเอ็นเอที่ถูกสร้างเพิ่มขึ้นในปฏิกิริยา qPCR หลายวิธี แต่ในที่นี้จะยกตัวอย่างมากล่าวเพียง 2 วิธี คือการใช้ SYBR green I และการใช้ Taqman probe

                SYBR green I เป็นสารที่สามารถจับกลับดีเอ็นเอสายคู่ได้ และเมื่อจับกับดีเอ็นเอสายคู่แล้วจะสามารถเปล่งแสงออกมาได้ ดังนั้นหากใส่ SYBR green I ลงในปฏิกิริยา qPCR เมื่อมีการสร้างดีเอ็นเอใหม่ออกมา สารดังกล่าวจะไปจับดีเอ็นเอแล้วเปล่งแสงออกมา ซึ่งจะถูกตรวจจับและนำไปแปลงเป็นปริมาณดีเอ็นเอออกมา ข้อดีของการใช้ SYBR green I ในปฏิกิริยา qPCR คือสะดวก ไม่ยุ่งยากซับซ้อน แต่มีข้อด้อยคือสารดังกล่าวจับกับดีเอ็นเอสารคู่แบบไม่จำเพาะ จึงทำให้สามารถใช้สำหรับการตรวจวัดปริมาณของดีเอ็นเอที่จำเพาะ เช่น ยีนใดยีนหนึ่งได้

                Taqman probe คือดีเอ็นเอสายเดี่ยวที่จำเพราะกับดีเอ็นเอที่ต้องการตรวจวัดปริมาณโดยปกติแล้วจะมีความยาวประมาณ 18 ถึง 22 นิวคลีโอไทด์ ปลาย 5’ ของ Taqmanprobe จะมีสารเรืองแสง(reporter dye) จับอยู่ส่วนปลาย 3’ ของ Taqmanprobe จะมีสารยับยั้งการเรืองแสง(quencher dye) จับอยู่ การที่สารยับยั้งการเรื่องแสงและสารเรืองแสงอยู่ใกล้กัน(ห่างกันเพียง 18 ถึง 20 นิวคลีโอไทด์) จะทำให้สารเรืองแสงไม่สามารถเรืองแสงได้ เมื่อใส่ Taqmanprobe ลงไปในปฏิกิริยา

qPCR Taqmanprobe จะไปจับกับสารพอลินิวคลีโอไทด์แม่แบบตรงตำแหน่งที่จำเพาะ และเมื่อ Taq polymerase (ที่จับอยู่กับสายพอลินิวคลีโอไทด์แม่แบบ) ทำการสร้างสายพอลินิวคลีโอไทด์สายใหม่เพื่อไปเข้าคู่กับสายพอลินิวคลีโอไทด์แม่แบบมาจนถึงบริเวณที่มี Taqman probe จับอยู่ Taq polymerase จะทำการย่อยสาย Taqman probe และหลุดออกจากสายพอลินิวคลีโอไทด์และอยู่ห่างจากสารยับย้งการเรืองแสงและสามารถจะเรืองแสงได้และแสงดังกล่าวจะถูกตรวจจับและนำไปแปลงเป็นปริมาณดีเอ็นเอออกมา

One thought on “เรียลไทม์พีซีอาร์(Real-times PCR)

  1. נערת ליווי says:

    A fascinating discussion is worth comment. I do think that you ought to publish more about this issue, it may not be a taboo matter but typically folks dont speak about such topics. To the next! Cheers!!

Leave a Reply

Your email address will not be published.