Knowledge Center, Molecular Biology, PCR & qPCR
PCR คืออะไร? หลักการทำงาน ประเภท และการประยุกต์ใช้ในงานวิจัยและการวินิจฉัย
Jul
PCR คืออะไร? หลักการทำงาน ประเภท และการประยุกต์ใช้ในงานวิจัยและการวินิจฉัย
บทนำ
Polymerase Chain Reaction (PCR) เป็นเทคนิคพื้นฐานที่ปฏิวัติวงการชีววิทยาโมเลกุล เนื่องจากสามารถเพิ่มจำนวนชิ้นส่วน DNA จากตัวอย่างเพียงเล็กน้อยให้มีปริมาณมากพอสำหรับการวิเคราะห์ภายในเวลาไม่กี่ชั่วโมง
ปัจจุบัน PCR ถูกใช้ในงานวิจัยด้านพันธุศาสตร์ การแพทย์ การตรวจโรคติดเชื้อ การตรวจมะเร็ง นิติวิทยาศาสตร์ การเกษตร และการพัฒนายา จึงถือเป็นหนึ่งในเทคนิคที่สำคัญที่สุดในห้องปฏิบัติการด้าน Biotechnology และ Life Sciences
PCR คืออะไร
PCR ย่อมาจาก Polymerase Chain Reaction เป็นเทคนิคที่ใช้เอนไซม์ DNA Polymerase เพื่อเพิ่มจำนวนชิ้นส่วน DNA เป้าหมาย (Target DNA) ผ่านกระบวนการเพิ่มจำนวนแบบเป็นรอบ (Thermal Cycling)
จาก DNA เพียงไม่กี่สำเนา สามารถเพิ่มเป็นล้านถึงพันล้านสำเนาได้ภายในเวลาไม่นาน
หลักการทำงานของ PCR
PCR ประกอบด้วย 3 ขั้นตอนหลัก
1. Denaturation
อุณหภูมิประมาณ 94–98°C
DNA สายคู่แยกออกเป็นสายเดี่ยว
2. Annealing
อุณหภูมิประมาณ 50–65°C
Primer จับกับตำแหน่งเป้าหมายของ DNA
3. Extension
อุณหภูมิประมาณ 72°C
DNA Polymerase สังเคราะห์สาย DNA ใหม่โดยต่อจาก Primer
ทั้งสามขั้นตอนนี้จะทำซ้ำประมาณ 25–40 รอบ เพื่อเพิ่มจำนวน DNA แบบทวีคูณ
ส่วนประกอบของปฏิกิริยา PCR
การทำ PCR ต้องใช้สารสำคัญ ได้แก่
- DNA Template
- Forward Primer
- Reverse Primer
- Taq DNA Polymerase
- dNTPs
- PCR Buffer
- Magnesium Chloride (MgCl₂)
- Nuclease-Free Water
คุณภาพของรีเอเจนต์แต่ละชนิดส่งผลโดยตรงต่อความแม่นยำของผลลัพธ์
ประเภทของ PCR
Conventional PCR
ใช้ตรวจว่ามีหรือไม่มี DNA เป้าหมาย และวิเคราะห์ผลด้วย Agarose Gel Electrophoresis
Real-Time PCR (qPCR)
สามารถวัดปริมาณ DNA ได้แบบเรียลไทม์ เหมาะสำหรับการวิเคราะห์การแสดงออกของยีน (Gene Expression) และการตรวจเชื้อ
Reverse Transcription PCR (RT-PCR)
ใช้ RNA เป็นสารตั้งต้น โดยเปลี่ยน RNA ให้เป็น cDNA ก่อนทำ PCR เหมาะสำหรับการศึกษาการแสดงออกของยีนและการตรวจไวรัส RNA
Digital PCR (dPCR)
แบ่งตัวอย่างออกเป็นปฏิกิริยาจำนวนมากเพื่อให้สามารถหาปริมาณ DNA ได้อย่างแม่นยำ เหมาะกับการตรวจการกลายพันธุ์ที่มีความถี่ต่ำ
การประยุกต์ใช้ PCR
PCR ถูกนำไปใช้ในหลายสาขา เช่น
- การตรวจโรคติดเชื้อ
- การศึกษาพันธุกรรม
- การตรวจการกลายพันธุ์
- การวิเคราะห์ยีน
- นิติวิทยาศาสตร์
- การตรวจความสัมพันธ์ทางสายเลือด
- งานเกษตรและความปลอดภัยทางอาหาร
- การพัฒนายาและวัคซีน
ปัจจัยที่มีผลต่อประสิทธิภาพของ PCR
- คุณภาพของ DNA Template
- การออกแบบ Primer
- ความบริสุทธิ์ของรีเอเจนต์
- ความเข้มข้นของ MgCl₂
- จำนวนรอบของ PCR
- ความแม่นยำของ Thermal Cycler
การปรับเงื่อนไขเหล่านี้อย่างเหมาะสมช่วยลดการเกิดผลลัพธ์ที่ผิดพลาดและเพิ่มความสามารถในการทำซ้ำของการทดลอง
ปัญหาที่พบบ่อย
ไม่พบแถบ DNA
อาจเกิดจาก
- DNA เสื่อมสภาพ
- Primer ไม่เหมาะสม
- อุณหภูมิ Annealing สูงเกินไป
มีหลายแถบ
สาเหตุอาจมาจาก
- Primer จับตำแหน่งไม่จำเพาะ
- Annealing ต่ำเกินไป
- จำนวนรอบมากเกินไป
Primer Dimer
เกิดจาก Primer จับกันเอง ทำให้เกิดผลิตภัณฑ์ที่ไม่ต้องการ และลดประสิทธิภาพของปฏิกิริยา
คำถามที่พบบ่อย (FAQ)
PCR กับ qPCR ต่างกันอย่างไร?
PCR ใช้เพิ่มจำนวน DNA และตรวจผลหลังจบปฏิกิริยา ส่วน qPCR สามารถติดตามการเพิ่มจำนวน DNA ได้แบบเรียลไทม์และวัดปริมาณได้
PCR ใช้ตรวจ RNA ได้หรือไม่?
ได้ แต่ต้องเปลี่ยน RNA เป็น cDNA ก่อนด้วยกระบวนการ Reverse Transcription
ทำไมต้องใช้ Nuclease-Free Water?
เพื่อป้องกันการย่อยสลาย DNA หรือ RNA จากเอนไซม์ DNase และ RNase ที่อาจปนเปื้อน
สรุป
PCR เป็นเทคนิคสำคัญที่ช่วยเพิ่มจำนวน DNA เพื่อการวิเคราะห์ในงานวิจัยและการวินิจฉัยโรค ความสำเร็จของการทดลองขึ้นอยู่กับการเลือกรีเอเจนต์ที่มีคุณภาพ การออกแบบ Primer ที่เหมาะสม และการควบคุมเงื่อนไขของปฏิกิริยาอย่างถูกต้อง
References
- Mullis K, Faloona F. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology.
- Green MR, Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
- Thermo Fisher Scientific. PCR Basics and Applications.
- Bio-Rad Laboratories. PCR Guide.
https://www.addgene.org/protocols/pcr/
