การเตรียมชิ้นส่วน cDNA

การเตรียมชิ้นส่วน cDNA หรือ complementary DNA

คือการเตรียมชิ้นดีเอ็นเอที่ต้องการจาก mRNA  โดยใช้ reverse transcriptase ซึ่งเป็นผลผลิตของยีนที่มีการแสดงออกเฉพาะบางเซลล์หรือบางเนื้อเยื่อในช่วงเวลาหนึ่งๆ เท่านั้น โดย mRNA นั้นจะมีแค่ส่วนของ exon(single copy DNA) เท่านั้นจึงสามารถถ่ายเข้าไปใน plasmid ของ Prokaryote เพื่อประโยชน์ในการ cloning ได้และเพื่อการศึกษา Gene expression ได้

หลักการสกัดอาร์เอ็นเอ

1. ทำให้เซลล์แตกและตกตะกอนโปรตีนโดย detergent และ phenol/chloroform ตามลำดับ
2. ตกตะกอนแยกอาร์เอ็นเอออกจากดีเอ็นเอ โดยใช้ LiCl

หมายเหตุ ในการสกัดดีเอ็นเอควรเติม DEPC(diethyl pyro carbonate)เพื่อยับยั้งการทำงานของ Rnase

หรืออาจเตรียมอาร์เอ็นเอบริสุทธิ์โดยใช้ oligo-T matrix หรือชุดสำเร็จรูป

การตรวจสอบคุณภาพของอาร์เอ็นเอ

คล้ายกับดีเอ็นเอ โดยถ้า A₂₆₀ /A₂₈₀   อยู่ในช่วง 1.7-2.0 แสดงว่าอาร์เอ็นเอที่สกัดได้บริสุทธิ์หรือมีคุณภาพดี

การสั่งเคราะห์     cDNA อาจจะทำได้หลายวิธี อาทิ

1. การเตรียม cDNA(complementary DNA) โดยใช้ primer ที่เป็น Oligo dT ใช้ S₁    nuclease หลักการคือ
2. สกัด eukaryotic     mRNA ซึ่งมี poly A tail ที่ปลาย 3’ ได้แล้ว
3. เริ่มทำการสังเคราะห์           cDNA โดยใช้ดีเอ็นเอไพรเมอร์ที่เป็น oligo Dt (หมายถึงมีเบส T หลายๆเบสต่อกัน)โดยไพร์เมอร์จะเข้าไปเกาะที่ปลาย 3’        mRNA แล้วใช้ mRNA เป็นแม่แบบเพื่อเริ่มทำการสังเคราะห์สายดีเอ็นเอ single strand DNA(ssDNA) ในทิศทาง 5’-à3’ โดยการทำงานของ reverse transcriptase จากไวรัส
4. เมื่อทำการสังเคราะห์ ss    cDNA มาถึงปลาย 5’         mRNA template พบว่า reverse transcriptase ยังคงสังเคราะห์สายดีเอ็ฯเอที่ปลาย 3’ ยาวออกไปอีหลายเบส(ซึ่งเบสส่วนปลายที่เกินมานี้จะเกิดโครงสร้างเป็นตะขอ( loop หรือ hook)               
5. ย่อย     mRNA template ด้วยด่าง(NaOH)       
6. ใช้ DNA polymerase I ทำหน้าที่สังเคราะห์สาย cDNA อีก 1 สายขึ้นมาในทิศทาง 5’-à3’ โดยใช้ cDNA อีก 1 สายขึ้นมาในทิศทาง 5’-à3’ โดยใช้ ss cDNA ที่สังเคราะห์ไว้แล้วเป็นแม่แบบที่มีบริเวณปลาย 3’ มีโครงสร้างคล้ายตะขอซึ่งทำหน้าที่เป็นเสมือนไพรเมอร์ สุดท้ายได้ดีเอ็นเอสายคู่(ds cDNA)
7. ทำการตัดดีเอ็นเอสายเดียว(บริเวณตะขอ) โดยใช้ S₁ nuclease